western blot原理是什麼？
1樓：清風聊生活
western blot法採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，經過聚丙烯醯胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，且能保持電泳分離的多肽型別及其生物學活性不變。
以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。
相關如下。原理：先製備蛋白質樣品，再利用sds-page原理，分離不同的蛋白質，再將分離的蛋白質進行轉膜，以便固定在新膜上進行抗原-抗體結合。
用固定在膜上的蛋白質作為抗原與對應的非標記抗體（一抗）結合。
由於此過程中，可能有未結合到抗原的抗體遺留，故需要清洗，以便儲存特異性結合的抗原-抗體結合物。抗原抗體結合物暴露出乙個fc片段，相應的二抗可以結合到這個片段上，形成抗原-一抗-二抗結合物。
再用相應的過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶標記到二抗上，由於加入的標記物相對質量分子很大，可以用離心作用將其沉澱下來，如果抗原與抗體結合，便可以一起沉澱下來，最後通過顯色反應或放射自顯影法便可檢測凝膠中的蛋白成分了。
western blot原理
2樓：薄雲暮涼
western blot原理如下：
western blot是一種常用的蛋白質分析技術，通過將目標蛋白從複雜的混合物中分離並定量檢測，以確定蛋白質的存在與表達水平。western blot技術包括樣品製備、蛋白質分離、轉移到膜上、蛋白質檢測和分析等步驟。
一、樣品製備與蛋白質分離
首先，需要從細胞或組織中提取目標蛋白，通常使用細胞裂解和蛋白質抽提試劑盒來破壞細胞膜並釋放蛋白質。然後，通過離心等步驟將提取的樣品進行純化和富集，以消除雜質和其他蛋白質的干擾。
二、sds-page膠電泳
將樣品中的蛋白質根據分子量大小進行分離是western blot的關鍵步驟。通常使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（sds-page）來實現這一目的。在sds-page中，通過將蛋白質樣品經過電泳使其在凝膠中遷移，根據分子量不同而分離成不同的條帶。
三、轉印至膜上啟陸
在sds-page分離完成後，蛋白質需要從凝膠悄前頃上轉移到膜上，以便後續的免疫檢測。這一步驟稱為電泳轉印（electrotransfer），通常使用半乾爐或溼式轉印系統。
通過在蛋白質上施加電流，將蛋白質從凝膠中轉移到膜上。常用的轉印膜包括聚偏氟乙烯（pvdf）膜和硝酸纖維素膜。
四、蛋白質檢測和分析
在蛋白質轉移至膜上後，需要進行蛋白質檢測和分析。第一步是阻斷，即使用蛋白質結合抑制劑悔瞎將膜上的非特異性結合位點阻斷，避免免疫檢測的背景干擾。第二步是免疫檢測，將特異性抗體與目標蛋白結合，並使用標記的二抗或酶標記的抗體進行檢測。
五、結果分析和資料獲取
通過western blot可以獲得蛋白質的存在和表達水平的資訊。這可以通過觀察免疫檢測結果中的蛋白質帶來判斷。使用成像系統（如化學發光系統或紫外線成像系統）獲取影象，並利用影象分析軟體進行定量分析。
western blot原理技術
3樓：花為誰栽
western blot (蛋白印跡)
wb是一種把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支援物(nc膜或pvdf膜)，並以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測。wb採用抗體作為探針，抗體可以與附著在固相支援物的靶蛋白的抗原表位發生抗原-抗體免疫反應。這種技術的作用是對細胞或組織提取的蛋白混合物(即總蛋白混合物)中的某一特異蛋白進行鑑別和半定量分析，旨在鑑別特異性蛋白的型別(如亞型、聚體、剪下體等)和蛋白表達量的變化。
其基本流程如下：
前面·我們已經介紹過sds-page，電泳完成後如果要進行western blot則需要轉膜。
轉膜：轉膜有溼轉和半乾轉兩種不同方法。我用的是半乾轉移法，膜覆蓋住膠，膜用balance buffer潤溼（甲醇溶液）,蓋子分別用top buffer和bottom buffer潤溼後蓋住，轉膜10min。
注意：1：膜大小合適，防止浪費。
2：蓋好膜和凝膠後，凝膠、膜 推平，否則會導致轉膜不完全。
3：注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜，避免手上的蛋白和油脂降低轉膜效率。
封閉：降低背景，佔據膜上剩餘的結合位點，使抗體只能與膜上的抗原特異性結合，一般用的是5%的脫脂奶粉，但值得注意的是對於磷酸化的抗體或生物素標記的抗體不能用脫脂奶粉，只能用5%的bsa。封閉時間室溫1-2h。
一抗孵育：封閉結束後，用pbst稍微洗膜後倒掉，再加入pbst搖10min，反覆洗三次後加入一抗+3%奶粉進行孵育2h，一般5ml，但上次我用10ml。一抗孵育時，要注意一抗的種屬**，我用的his標籤，所以一抗是anti-his。
一抗可以反覆使用2-3次。
pbst 溶液 pbs 溶液中加入 吐溫。
洗膜：用pbst進行洗膜，10min/次，洗3-4次即可。
二抗孵育：洗膜結束後，後加入二抗+3%奶粉5ml孵育1h，再次洗膜。注意二抗的種屬要與一抗的**相對應，例如我的一抗是鼠抗，我的二抗是羊抗鼠。
檢測：按 1：1 比例吸取顯影液中的 a 液和 b 液於 ml ep 管中混合，一塊膠100μl，後將混合液均勻滴加在 pvdf 膜上，用塑封袋將 pvdf 膜封好，放入顯影儀中進行顯影 (速度要快，儘量減少底物消耗)。
western blot實驗步驟
4樓：小樣
western blot實驗操作步驟如下：
1. 準備樣品。
1）製冰，準備冰盒。
2）配製細胞裂解液：根據細胞數量確定所需裂解液：50ul/六孔板一孔 。
裂解液配方：100ul碧雲天裂解液+1ul蛋白酶抑制劑混合物+1ul pmsf
3）按實驗需要準備好細胞：去掉培養基，1×pbs洗3次（去掉培養基中的血清），每個孔（6孔板）加入適量的裂解液。迅速用細胞刮刮下細胞並轉移至管中，置於冰上20min，振盪混合後，再置冰上10min。
2. sds-page 聚丙烯醯胺凝膠電泳：製備分離膠（5ml/gel）
3. 膜轉移。
1) 切膠，按marker指示和目的條帶的位置切膠(注意將膠切角做記號)，將洗脫的膠浸入轉膜緩衝液中15分鐘。
2) pvdf膜做好記號後先浸入甲醇中1分鐘，再連同4張3mm濾紙和海綿浸入轉移緩衝液中15分鐘。
western blot實驗步驟
5樓：讓夢浮於心上
組織（小鼠十二指腸）蛋白提取。
準備： 研磨珠、離心管、生理鹽水、ripa蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑，磷酸化蛋白酶抑制劑，移液槍，槍頭，手套，冰，渦旋儀，4℃離心機；
在ripa蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑（根據說明書確定加入量）
2.研磨： 提前在離心管中分裝300μl ripa蛋白裂解液並放入2顆研磨珠，稱取100mg左右樣品，置於勻漿機中充分研磨；
3. 蛋白裂解： 將樣品置於冰上裂解2h, 期間於渦旋振盪器上**2-3次；
4. 蛋白收集： 將裂解後的樣品4℃ 12000rpm離心10min，取上清置於新的ep管中備用。
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用westernblot檢測蛋白有兩個蛋白分子量都是
最好來是能分開做，分子量自 一樣的兩個蛋白雖然可以洗掉重新砸抗體，但是據我的經驗一般這種都洗的不是很乾淨，而且只能洗掉二抗，若二抗一樣就不能判斷是哪種蛋白，分子量相差那麼遠的倆個蛋白，在一張膠上，轉膜會很麻煩，會出現小分子量轉過，大分子量還沒轉到膜上的現象 為什麼western blot結果中，蛋白...