1樓:路戍人
背景copy校正程式測量bai
定量pcr儀所使用的反應管和水的du空白熒光強度。在zhi執行校正程式期間,定量daopcr儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度,訊號收集的溫度為60°c。隨後,sds軟體計算所收集到的熒光強度的平均值,提取結果並儲存到校正檔案中。
軟體在今後的分析中將自動呼叫此校正檔案,從實驗資料中扣除背景訊號。
什麼是純熒光校正,多長時間校正一次:
純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和訊號強度,通俗地說是讓儀器「認識」各種熒光染料。軟體收集並儲存各種純熒光染料標準品的熒光資訊。以後每次定量實驗執行過程中,sds軟體收集樣品的原始光譜訊號,並將此原始光譜與純熒光檔案中的資料進行比較,精確扣除不同染料的訊號重疊部分,從而確定樣品中的熒光染料種類和訊號強度。
推薦每半年進行一次純熒光校正。在執行光譜校正之前,請先進行背景校正和roi校正。
熒光定量pcr的熒光訊號強度和什麼有關係
2樓:南京金益柏生物科技****
常規pcr中,在擴增反應結束之後,我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析,無法對pcr擴增反應進行實時檢測,也無法對起始模板準確定量,而很多情況下,我們所感興趣的是起始模板量,如轉基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數或者病人中某種病毒dna/rna的精確copy數等,如此,熒光定量pcr技術便應運而生。
1、熒光定量pcr概念
所謂定量pcr技術(real-time pcr),是指在pcr反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號累積實時監測整個pcr程序,最後通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法
2、熒光定量pcr與普通pcr的主要區別
理論上pcr是一個指數增長的過程,但是實際的pcr擴增曲線並不是標準的指數曲線,而是s形曲線。這是因為隨著pcr迴圈的增多,擴增規模迅速增大,taq酶、dntp、引物,甚至dna模板等各種pcr要素逐漸不敷需求,pcr的效率越來越低,產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的taq酶都被飽和以後,pcr就進入了平臺期。
由於各種環境因素的複雜相互作用,不同的pcr反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化,難以精確控制。所以,即使是96次pcr重複實驗,各種條件基本一致,所得結果有很大差異(如下圖),所以在實驗過程中我們不能根據最終pcr產物的量直接計算出起始dna拷貝數。
3.2熒光閾值
我們一般把熒光pcr的前15個迴圈訊號作為熒光本底訊號(baseline,基線期),即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值,擴增的熒光訊號被熒光背景訊號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值,它可以設定在熒光訊號指數擴增階段任意位置上,熒光域值的預設設定是3~15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍(機器自動設定)。我們在做熒光定量pcr實驗時,經常採用手動設定,手動設定的原則要大於樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值,同時要儘量選擇進入指數期的最初階段,真正的訊號是熒光訊號超過域值。
熒光定量pcr有非特異性擴增怎麼解決
3樓:匿名使用者
熒光定量pcr有非
來特異性擴自增怎麼解決
從你這個圖上看,這是非特異性的擴增。訊號非常弱,而且都超過40個迴圈還沒有訊號。 之所以前面有下降,其實都是背景噪音訊號。
你看縱座標的數值都非常的校所以不是真正的擴增訊號,都是背景噪音干擾而已。沒有任何擴增產物。實時pcr產物的tm值大小一般會在80deg;上下,所以溶解曲線不必從40deg;開始,可以從65deg;開始進行溶解曲線繪製,另外在產物之前出現的小峰,同時也在陰性對照中出現了,應該是引物二聚體或者是非特異的擴增。
如何避免熒光定量pcr檢測技術的實驗誤差
4樓:北京索萊寶科技****
避免熒光定量pcr檢測技術的實驗誤差的方法如下:
樣品的處理及選取
處理樣品時,必須確保樣品都得到了充分的處理。選取實驗樣品時,要保證選取的組織儘可能的純,不要汙染其他組織,樣品選好後,即可放入液氮或超低溫冰箱儲存。
核酸提取
加入液氮研磨要徹底,蛋白、多糖、多酚類物質要去除乾淨,確保得到高質量的核酸,分光光度計檢測核酸質量,rna od260/280=2.0左右,dna od260/280=1.8左右,最好再做電泳檢測;同一樣品要提取2到3個rna,所剩餘的樣品不要丟棄,繼續低溫儲存。
得到的rna立即反轉錄為cdna,rna樣品最好不要存放。
對於精度要求較高的定量pcr,最好先在樣品的所有組織型別內做內參基因的穩定性分析,找到表達恆定基因作為內參。
做定量pcr時,先把除模板外的所有試劑預混,然後分裝到pcr管中,分裝時儘量採用排槍,加樣時儘量採用排槍。
體系中最好參入rox參比熒光,消除光程差和加樣的偏差。
重複操作
讓重複操作最大的修正偏差。最有意義的重複是提取樣品rna時就重複,同一個樣品,分別提取3份rna,3份rna都做反轉錄,所得的3份cdna都做定量pcr檢測,這樣的重複之所以最有意義是因為我們把rna提取、反轉錄、上機檢測三步做了重複,這樣得出的平均值要比只在上機檢測時對同一cdna樣品做三個重複要有意義的多。
同一個cdna樣品做三個重複定量檢測求平均值主要是消除加樣時的誤差,排槍加樣時,誤差很小,加樣時的誤差可以通過設幾個重複檢測出來。
5樓:匿名使用者
誤差是難以避免的 只要操作的時候小心。相關係數要想接近1,最好去掉一個不是很準的點,或者可以做三組標準品的平行,最好是事先把所有東西都混成一個mix,然後三個孔一起加。
如何看熒光定量pcr的結果，如何看熒光定量PCR的結果
按公式計算 對照組 ct 對照組 ct 目的基因 ct 內參基因 對照組 ct 目的基因 ct 內參基因 實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析？1 如果有標準曲線，按照標準曲線計算 2 一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算 3 引物或探針降解 可通過page電泳檢測其完整性 4 ...
如何設計熒光定量pcr的引物及taqman探針
用專門的試劑盒來做吧，然後按照說明書操作，挺方便的。我們實驗室以前用的biog熒光定量pcr試劑盒，反應挺靈敏的，實驗結果也不錯，而且染料法和探針法都有。可以用引物設計軟體，primer5就挺不錯的。你是要檢測dna還是rna？探針法檢測dna的話可以用biog super probe kit，檢測...
實時熒光定量PCR與普通PCR的區別是什麼？結果有何異同？能
二者結果相同。都能說明生物體外的特殊dna複製的整個過程的擴增效率和溶解溫度情況。區別 1 二者系統組成不同 熒光定量pcr儀比普通的pcr儀多了熒光訊號採集系統和計算機分析處理系統。2 二者原理不同 熒光定量pcr實時監測與dna結合的熒光染料激發的熒光，普通ocr通過檢測插入dna中核算染料的量...