如何看熒光定量pcr的結果,如何看熒光定量PCR的結果

2021-04-18 02:33:45 字數 5160 閱讀 4940

1樓:南京金益柏生物科技****

按公式計算:對照組-δδct =對照組(ct 目的基因-ct 內參基因)-對照組(ct 目的基因-ct 內參基因)

實時熒光定量pcr的結果該怎樣分析?

2樓:群英鬥將

1、如果有標準曲線,按照標準曲線計算;

2、一般都是相對量,則用delta delta ct方法來計算;

3、引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性;

4、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;

5、看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料,ct值一般在35左右就失去參考價值了,平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

擴充套件資料:

pvr的迴圈引數:

1、預變性;

模板dna完全變性與pcr酶的完全啟用對pcr能否成功至關重要,加熱時間參考試劑說明書。

2、變性步驟;

迴圈中一般95℃,30秒足以使各種靶dna序列完全變性,可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。

3、引物退火;

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。

4、引物延伸;

引物延伸一般在72℃進行(taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

5、迴圈數;

大多數pcr含25-35迴圈,過多易產生非特異擴增。

6、最後延伸;

在最後一個迴圈後,反應在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸完全,並使單鏈產物退火成雙鏈。

3樓:南京金益柏生物科技****

用2-△△ ct法算的話,應如何算? 假設檢測a基因,ct分別為(這裡記住ct越大,表明相對含量越低) 普通組/test1:28 實驗組1/test2:

29 實驗組2/test3:30 這時候要設對照了,假設test1為對照組(普通組),當然是以普通組為對照 那麼,相對含量為。

4樓:匿名使用者

看ct值、起始拷貝數、標準偏差等

如果是sybr做的話,再看下溶解曲線

實時定量pcr的結果是怎樣分析的

5樓:小乾乾

1、如果有標準曲線,按照標準曲線計算。

2、一般都是相對量,則用delta delta ct方法來計算。

3、舉例如下:對照組基因a的ct值為20, 內參(比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18,內參ct值14。

4、首先算加樣量:delta ct=15-14=1。2的1次方是2。

也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。

2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍,所以4處以2=2,最後的相對量是2倍。

5、幾點注意:必須確定擴增的特異性,只有相同目標的ct值才能相減(擴增效率有可能不同),2的某次方只是理論值,實際擴增效率低於2,最好不用syber green。

6樓:豆村長de草

實時熒光定量pcr技術是在pcr反應體系中加入熒光基團,利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

基線在pcr擴增反應的最初數個迴圈裡,熒光訊號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即基線。光域值threshold的設定,一般將pcr反應前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號,熒光域值是pcr3-15個迴圈熒光訊號標準差的10倍,熒光域值設定在pcr擴增的指數期。

融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的,如果產物是單一條帶,融解曲線就會出現一尖峰;如果有引物二聚體或其它非特異性擴增,就會出現至少兩個尖峰。

擴充套件資料:

時熒光定量pcr儀real-time qpcr 常見問題分析:

1、無ct值出現

1)檢測熒光訊號的步驟有誤:一般sg法採用72℃延伸時採集,taqman法。則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號;

2)引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性;

3)模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;

4)模板降解:避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。

2、ct 值出現過晚(ct>38)

1)擴增效率低:反應條件不夠優化,設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等;

2)pcr各種反應成分的降解或加樣量不足,

3)pcr產物太長:一般採用80-150bp的產物長度。

3、標準曲線線性關係不佳

1)加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度;

2)標準品出現降解:應避免標準品反覆凍融,或重新制備並稀釋標準品;

3)引物或探針不佳:重新設計更好的引物和探針;

4)模板中存在抑制物,或模板濃度過高。

7樓:匿名使用者

實時定量pcr的結果是可以和所有核酸結合,沒有特異性。

要保證特異性的話,最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積,比如同時10微升的體系,對照組加1微升dna,實驗組加2微升dna,則實驗組的加樣量是對照組的2倍。

看ct值是分析熒光定量pcr最直觀的一個資料,ct值一般在35左右就失去參考價值了,平時我們實驗室用biodai-pcr熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

擴充套件資料:

real-time qpcr 常見問題分析:

一、無ct值出現

1、檢測熒光訊號的步驟有誤:一般sg法採用72℃延伸時採集taqman法。

則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。

2、引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性。

3、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

4、模板降解:避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。

二、ct 值出現過晚(ct>38)

1、擴增效率低:反應條件不夠優化,設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等。

2、pcr各種反應成分的降解或加樣量不足。

3、pcr產物太長:一般採用80-150bp的產物長度。

三、標準曲線線性關係不佳

1、加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度。

2、標準品出現降解:應避免標準品反覆凍融,或重新制備並稀釋標準品。

3、引物或探針不佳:重新設計更好的引物和探針。

4、模板中存在抑制物,或模板濃度過高。

四、負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰

1、引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。

2、引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,並注意上下游引物的濃度配比。

3、鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix 試劑盒。

4、模板有基因組的汙染:rna提取過程中避免基因組dna 的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

五、擴增效率低

1、反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2、反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

3、反應體系中有pcr反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。

8樓:寵愛認

常見分析角度:

1.無ct值出現

(1)檢測熒光訊號的步驟有誤:一般sg法採用72℃延伸時採集,taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號;

(2)引物或探針降解:可通過page電泳檢測其完整性;

(3)模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;

(4)模板降解:避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。

2.ct 值出現過晚(ct>38)

(1)擴增效率低:反應條件不夠優化,設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等;

(2)pcr各種反應成分的降解或加樣量不足,

(3)pcr產物太長:一般採用80-150bp的產物長度。

3.標準曲線線性關係不佳

(1)加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度;

(2)標準品出現降解:應避免標準品反覆凍融,或重新制備並稀釋標準品;

(3)引物或探針不佳:重新設計更好的引物和探針;

(4)模板中存在抑制物,或模板濃度過高。

4.負對照有訊號、溶解曲線不止一個主峰

(1)引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和髮夾結構的出現;

(2)引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,並注意上下游引物的濃度配比;

(3)鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix 試劑盒;

(4)模板有基因組的汙染:rna提取過程中避免基因組dna 的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

5.擴增效率低

(1)反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解;

(2)反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度或改為三步擴增法;

(3)反應體系中有pcr反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。

熒光定量pcr檢驗報告結果怎麼看?

9樓:萬山善草

你的乙肝病毒檢驗結果是64700000 iu/ml ,病毒量大傳染性強,複製活躍。

10樓:小李1飛豬

病毒量有點高,到相應科室在醫生指導下進行抗病毒**,<1.0x10`3 iu/ml即dna陰性即可~

11樓:慈卿時令梓

原來是32900000,現在是5680

肯定是好轉了

肝功能如果就那項高一點點,其他都正常的話可以說是肝功能正常現在就這麼辦,不需要**

如何看熒光定量pcr檢驗報告單

熒光定量pcr結果怎麼表示??怎麼進行統計學處理??

12樓:潛龍9勿用

這個可能是做了多個重複吧,δδct=0,那是平均數,實際上可能做了多個重複。

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