1樓:南京金益柏生物科技****
你提供的檔案非常好,只是沒有涉及雙內參的問題,我的實驗用了兩個內參基因,現在問題是不知道怎麼處理這樣的資料。謝謝你的回答~
2樓:圖拉的草原
樓主,我現在也遇到這樣的問題了,能不能把你最後怎樣處理雙內參的方法告訴我,萬謝了!
實時熒光定量pcr內參是什麼東西
3樓:禾鳥
1、實時熒光定量pcr內參:
在不同的pcr反應管中已定量的內參和引物,內參用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內參也被擴增。
在pcr產物中,由於內參與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內參為對照定量待檢測模板。
2、選擇:內參一般是固定的,可以用實驗室之前就有的。或者用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記,下游引物不標記。
擴充套件資料
(1)內參在傳統定量中的作用:
由於傳統定量方法都是終點檢測,即pcr到達平臺期後進行檢測,而pcr經過對數期擴增到達平臺期時,檢測重現性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重複實驗,所得結果有很大差異,因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。
加入內參後,可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
(2)內參對定量pcr的影響:
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標,則pcr反應變為雙重pcr,雙重pcr反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時,這種競爭會表現得更為顯著。
但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的,所以無法加入合適數量的已知模板作為內參。也正是這個原因,傳統定量方法雖然加入內參,但仍然只是一種半定量的方法。
4樓:小笑聊情感
實時熒光定量pcr內參是一種在dna擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(pcr)迴圈後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進行定量分析的方法。
5樓:匿名使用者
內參就是一個表達量在各個組基本保持不變的基因,又叫看家基因,比如常用的gapdh, actin。或者18s rrna也可以。
如果內參表達量一致,說明你pcr的上樣量一致,樣本的質量也一致。如果出入很大,說明你的樣本的濃度或者是質量有問題。測到的目的基因的表達量就不可靠了
6樓:匿名使用者
管家基因,具體可以諮詢公司,也可以自己看文獻,常用的有gapdh,beta-actin和18srna,根據不同的**選用不同的管家基因,比如gapdh就被人詬病做癌細胞基因時超不準。。。
7樓:xueling黃
如果對內參要求很高的話,可以篩選合適內參,有免費的軟體,比如genorm,normfinder等
請問熒光定量pcr進行相對定量時,若是目的基因和內參基因擴增效率不一致,為什麼會導致結果的不準確?
8樓:匿名使用者
你先得弄清相來對定量什麼自
意思,舉個例子,樣bai品a和樣品b中檢測基因duy的表達水平,以b-actin為內
zhi參,相對定量就dao是用樣品a中的基因y的量除以b-actin得到值y1,用樣品b中的基因y的量除以b-actin得到值y2,然後y1/y2就是基因y在樣品a和b中的相對錶達水平。若基因y和b-actin擴增效率不一致,那麼y1/y2就不能反映實際情況了。
擴增效率是由退火溫度和引物效率決定的,需要試多個退火溫度和多對引物,希望有幫助
9樓:匿名使用者
相對定量有抄兩種方法。要求擴增效率相同的是δδct法,因為只有擴增效率相同目的基因與內參基因的ct值之差才是恆定的值,這是使用這種方法處理資料的前提,所以正式實驗之前要進行條件優化,這種方法的優勢是不用作標準曲線。如果擴增效率不同就要用另一種雙標準曲線法,這種方法需要標準品,稀釋不同的濃度梯度,作標準曲線,根據標準曲線得到你的拷貝數在進行資料處理,得到相對值。
希望能對你有幫助......
熒光定量pcr的內參和目的基因一定要放一起嗎
10樓:匿名使用者
內參就是一個表達量在各個組基本回保持不變的基因,答又叫看家基因,比如常用的gapdh, actin。或者18s rrna也可以。
如果內參表達量一致,說明你pcr的上樣量一致,樣本的質量也一致。如果出入很大,說明你的樣本的濃度或者是質量有問題。測到的目的基因的表達量就不可靠了
11樓:魚骨頭
熒光定量pcr的內參和目的基因都在同一樣品裡,做的時候內參和目的基因都要做,只是內參和目的基因所加的引物不同
12樓:南京金益柏生物科技****
不一定啊,只要保證同時做就行了,內參要和目的基因同時做
請問我在做熒光定量pcr的時候內參的ct值很低大約在35左右,而目的基因ct值在25左右 有哪位高手能指點一下
13樓:匿名使用者
你選了個什麼內參,表達量如此之低?感覺有點問題,檢查一下融解曲線對不對。
如果是正確的,說明你的目的基因表達量比內參高出一千倍啊。
ct值越大,表達量越低。
14樓:糟油酒丸
看看你的gapdh引物tm多少,有可能是因為pcr條件適合目的基因引物對而不適合內參引物對嗎?
最近在做microrna的熒光定量pcr,用u6做內參,想請教一下,u6的ct值在什麼範圍內,目的基因表達呈線性關係 5
15樓:匿名使用者
我最近也要做mi rna的熒光定量pcr,用u6做內參
,但是苦於沒有找到u6的基因序列(ncbi裡面有好多種,版不曉得哪一個是),寶生物
權那邊以前有現成的u6引物,但現在不生產了,說只能自己提供基因序列,他們設計和合成,哎!想問一下樓主你的u6引物在哪個公司設計和合成的呀?需要提供基因序列麼?
是人的還是小鼠或其他物種的u6?如果方便的話,可否提供一下小鼠的u6基因序列呢?多謝!
16樓:匿名使用者
你做一下標準曲線不就知道了,2小時的事情
熒光定量pcr溶解曲線為什麼會有急劇的上升連著急劇下降
隨著溫度升高，當溫度達到tm值時候，dna就會變性分成單鏈的，此時熒光染料不內能結合nda所以檢測 容的熒光型號越來越弱。你說的出現的峰是熒光性號對溫度求導後得到的曲線圖，出現峰是因為在接近tm值的位置熒光性號下降的斜率很快導致在對溫度求導後出現峰。出現單峰說明沒有非特異性的結合和引物二聚體的產生。...
請問我這個實時熒光定量PCR融解曲線為什麼是從負值開始的？結果可用嗎
看這個結果有幾個猜想 1 如果之前做實驗的時候，儀器沒有出現過這種情況，有可能是儀器出現錯誤，建議重啟一下，或者改軟體需要重新校準一下。2 從這個結果來看，引物應該是可以用的，主峰也只有一個，特異性還是有的，不過還要參考一下擴增曲線，ct值如果在35個迴圈以內，應該是沒有問題的。怎麼理解熒光定量pc...
熒光定量pcr擴增曲線基線過高什麼原因
最常見的是樣本的擴增效率很差,所以到了平臺期也不是很強,這樣基線就相對很高了。熒光定量pcr擴增曲線基線過高什麼原因 探針濃度過高 體系中有熒光物質汙染 擴增效率低 我師兄用biog熒光定量pcr試劑盒擴增效果特別好,曲線非常典型,反應速度也很快,沒有遇到這個問題 熒光定量pcr擴增曲線基線過高什麼...