1樓：匿名使用者
最近我bai們也在作感受態細胞轉du化
做轉化時zhi
一定要注意用冷的氯化鈣，dao還可以在加入回後42度熱休克90秒，這樣效答
果比較好。
篩選時我們用的質粒中有氨卞黴素的抗性，所以只是在培養基中加入氨卞黴素就成了。但是藍白篩選不是白色的是轉入質粒的麼？籃斑是沒轉入的啊。
2樓：
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中國生物論壇
菌落生長密,顯然是稀釋度的問題。
至於無陽性,最大的
回可能是感受態細胞製備答,如果可能,直接購買公司製備好的感受態細胞吧;其次可能就是轉化的條件;
建議你看看分子克隆實驗指南第三版.
什麼叫感受態細胞？什麼叫轉化
3樓：匿名使用者
感受態細胞指的是經處理後，處於能吸收周圍環境中dna分子生理狀態的微生物細胞，在轉基因技術操作過程中要將重組dna分子匯入微生物受體細胞時就需要用感受態細胞。所謂轉化是目的基因進入受體細胞並在受體細胞中維持穩定和表達的過程。
感受態細胞的轉化要注意些什麼
4樓：匿名使用者
注意事項：
1．實驗中所需氯化鈣於冰浴後再使用
2．使用離心機前，要嚴格保證離心物品充分平衡，以免造成離心機損傷3．大腸桿菌感受態一定放冰上溶化
4．熱激和冰浴時間要科學把握
5樓：匿名使用者
此外（1）質粒dna的質量和濃度，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，則會使轉化率下降;ml左右，且注意防止被其它試劑。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同），大於30kb的重組質粒將很難進行轉化：所用的cacl2等試劑均需是最高純度的。
對tg1菌株。所有的試劑都要滅菌。對於以質粒為載體的重組分子而言：
用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，並經高壓滅菌處理，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。一般地。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳，所用器皿，並用最純淨的水配製，細胞密度在5×107個/：
整個操作過程均應在無菌條件下進行，分子量大的轉化效率低，移液槍頭等最好是新的，不能離開冰浴，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，否則細胞轉化率將會降低，可通過測定培養液的od600控制、dna酶或雜dna所汙染，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比。密度過高或不足均會使轉化率下降。不要用已經過多次轉接。
（二）感受態細胞轉化中的影響。（2）感受態細胞的質量。整個操作均需在冰上進行，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，實驗證明，及貯存在4℃的培養菌液，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子，最好分裝儲存於4℃ （3）細胞的生長狀態和密度 最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入，od600為0．5時，如離心管
用鈣離子處理成為感受態細胞的轉化方法
6樓：匿名使用者
原因：目的基因匯入植物細胞時，由於沒有經過鈣離子處理沒有變成感受態細胞，細胞的通透性小，目的基因難以進入細胞。
感受態細胞主要原理：
1、通過處理使細胞的通透性變大。
2、使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。
3、由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
擴充套件資料：
氯化鈣法：
1、將快速生長的大腸桿菌置於經低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹，同時ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區域，誘導細胞成為感受態細胞。
2、此時，將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動，並隨機出現許多間隙，外源dna就可能被細胞吸收。進入細胞的外源dna分子通過複製、表達，實現遺傳資訊的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。
3、將轉化後的細胞在選擇性培養基上培養，篩選出帶有外源dna分子的陽性克隆。
7樓：無語翹楚
感受態細胞（competent cell）：理化方法誘導細胞，使其處於最適攝取和容納外來dna的生理狀態。
主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
1. 將快速生長的大腸桿菌置於經低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹；
ca離子會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區域，誘導細胞成為感受態細胞細胞膜通透性發生變化，極易與外源dna相粘附並在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣複合物。
聯合其它的二價金屬離子（如mn、co）、dmso或還原劑等物質處理，可使轉化率提高100～1000倍。
2. 將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動，並隨機出現許多間隙，外源dna就可能被細胞吸收。進入細胞的外源dna分子通過複製、表達，實現遺傳資訊的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。
3.將轉化後的細胞在選擇性培養基上培養，篩選出帶有外源dna分子的陽性克隆。
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總之ca離子使dna沉澱於細胞表面（類似真核轉染的磷酸鈣共沉澱），0-42℃的熱衝擊使得膜表面出現裂痕（很快會被自動修復-疏水作用）使得膜表面dna被攝入。
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大腸桿菌是格蘭陰性，細胞壁就是肽聚糖+外膜（脂蛋白、脂質雙層、脂多糖）
這種細胞壁結構除了作為內毒素使機體發熱、白細胞增加之外（當然還可以為此細菌形態、耐藥性、結合mg2+維持離子平衡），與細胞膜出現裂痕吸收dna並沒有什麼關係。
8樓：匿名使用者
用鈣離子處理成為感受態細胞的轉化只是使得細菌處於敏感狀態，並沒有涉及到基因的轉移。
9樓：為水情狂
先要改變細胞膜的通透性 才能使物質進入
轉化感受態細胞是否需要載體？
10樓：匿名使用者
可要，可不要。
感受態細胞：主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
感受態細胞制好後轉化不成功
轉化感受態細胞的目的是什麼
11樓：匿名使用者
將構建好的載體轉入感受態細胞進行表達，不僅可以檢驗重組載體是否構建成功，最主要的是感受態細胞作為重組載體的宿主可以進行後續實驗，如蛋白質表達純化等工作
12樓：匿名使用者
因為細胞處於感受態是最容易轉入外源dna的時候，轉入之後的操作樓上已經說了～～
手上沾了感受態細胞液，感受態細胞的製備時有什麼注意事項
沒關係的，清洗乾淨就可以了，感受態細胞就是處理過的用來擴增dna的普通細胞，在手上也不會有什麼傷害，不用擔心 感受態細胞的製備時有什麼注意事項 1 培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有...
製作感受態細胞時寅要加抗生素嗎,製作感受態細胞時搖菌要加抗生素嗎
pmd18t連一段多長的dna,連線dna用量及時間?轉化到哪個感受態細胞中?amp抗性平板長菌情況如何?仔專細觀察以上問題,屬考慮是否轉化不成功。培養基的體積是否小於試管體積的1 5?搖菌轉數是否達到250rpm,試管要斜放?是否觀察過菌體生長過程 2 6小時生長情況 是否有噬菌體汙染?如果轉化成...
在大腸桿菌感受態細胞的製備及轉化實驗中
兩個目的 1熱激後的大腸桿菌細胞比較脆弱,培養可以恢復細胞的活性 2進一步培養,提高菌液中大腸桿菌的濃度。為什麼大腸桿菌感受態細胞製備和轉化 轉化實驗用bai液態的lb是為了讓細du胞恢復培 zhi養,也有人稱 之為讓其孵育,質dao粒或其他經專在液態lb中恢復屬培養後再塗布平板 固態培養基 是為了...