1樓:匿名使用者
你好,擴增曲線可以粗略地判斷擴增效率。sybr green的雙delta ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一回
致。如果答不一致,需要對公式進行修正,部分qpcr儀的配套軟體可以做到,直接輸入每對引物的擴增效率。但無論如何,保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。
如果擴增效率一致,不同ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移,其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣,一條比較「陡」,另一條比較「平」,那麼意味著擴增效率不一致。有可能是引物效率不一,或者個別樣品、反應孔存在抑制pcr的汙染等。
請教下大神,實時定量pcr(qpcr)實驗,看擴增曲線的意義是什麼?
2樓:科研高手
你好,擴增曲線可以粗略地判斷擴增效
率。sybr green的雙delta ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一致。如果不一致,需要對公式進行修正,部分qpcr儀的配套軟體可以做到,直接輸入每對引物的擴增效率。
但無論如何,保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。如果擴增效率一致,不同ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移,其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣,一條比較「陡」,另一條比較「平」,那麼意味著擴增效率不一致。
有可能是引物效率不一,或者個別樣品、反應孔存在抑制pcr的汙染等。
來自:肽度時界威客吳博士,有科研難題、科研需求就上肽度時界吧!
我是熒光定量pcr初學者,現在想做定量試驗,最近做了個標準曲線,可是內參和目的基因的點都不**上。
3樓:水行船
可以78°C讀板,這樣ct值就只是產物的值了,另外你的ntc可能是汙染了,稀釋的過程中也要防止汙染,尤其是標準品,
4樓:匿名使用者
從溶解曲線上看,確實有非特異性的擴增,在75度左右的小峰。樣本的濃度越低,這個非特異的干擾就越大。最好不要用sybr green做。改用探針吧
5樓:匿名使用者
qpcr手抖一下就好幾倍的差別甩出去的 啥樣的結果都挺正常 多做幾次取個最穩定的結果就行了
定量pcr目的基因擴增曲線不好但是ct值很高怎麼回事
6樓:南京金益柏生物科技****
你反轉bai錄後的cdna的濃度測了沒有?
du完zhi全可以增加模板dao量,體系中的水全部內用模板替代。容提取rna時候注意在冰上進行免得降解現在血清裡內參好像沒統一標準,我用gapdh,β-actin效果都不太好;
另外,我做的血清提rna,濃度不高,最後跑出來ct值最小的也在30以上。
實時定量pcr擴增曲線怎麼分析
7樓:南京金益柏生物科技****
可能是模板濃度太低了,都沒有達到閾值的,剛開始要做不同濃度梯度的,摸一下模板濃度條件
8樓:桑桑雙子的老巢
你好,擴增曲線可以粗略地判斷擴增效率。sybr green的雙delta ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一致。如果不一致,需要對公式進行修正,部分qpcr儀的配套軟體可以做到,直接輸入每對引物的擴增效率。
但無論如何,保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。如果擴增效率一致,不同ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移,其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣,一條比較「陡」,另一條比較「平」,那麼意味著擴增效率不一致。
有可能是引物效率不一,或者個別樣品、反應孔存在抑制pcr的汙染等。
來自:肽度時界威客吳博士,有科研難題、科研需求就上肽度時界吧!
怎麼通過q-pcr的擴增曲線和溶解曲線來分析結果,如何通過曲線來判斷結果的好與壞?
9樓:匿名使用者
1、擴增曲線(如果做雙δct法):
(1)擴增曲線必須是s型,有明顯的四個時期,且復孔的ct值儘量一致,相差不要超過0.5個ct值(上限是1個ct值);
(2)同一個基因在不同濃度的相同模板下擴增,其相差的ct值為相差濃度倍數的2次開方。當然這是理論值;另外陰性對照不能有擴增(40個迴圈以後出ct值屬正常現象,也可算作沒有擴增)。
2、溶解曲線:
(1)溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線,顧名思義,其跟模板(或其濃度)沒有關係,擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線;
(2)一般sybr法的目的基因在80~90°C之間;
(3)出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體(一般為60~75°C之間)視引物長度而定,而基因組dna汙染的峰會在90°C以後。出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因所致;
(4)基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染,注意實驗操作等避免模板汙染。
3、溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性的,要是溶解曲線是單峰說明產物只有一條,結果較好;要是雙峰說明產物不特異,可能存在引物二聚體或非特異性擴增,有可能引物設計有問題。
10樓:匿名使用者
具體要看你做什麼實驗,模板和擴增的基因實怎樣的。
1、擴增曲線:一般來說如果你做雙δct法那麼你的擴增曲線必須是s型,有明顯的四個時期,且復孔的ct值儘量一致,相差不要超過0.5個ct值(上限是1個ct值);同一個基因在不同濃度的相同模板下擴增,其相差的ct值為相差濃度倍數的2次開方。
比如同一種cdna5倍濃度稀釋,那麼同一種基因擴增的前提下,5倍濃度模板的ct值會比1倍濃度模板的ct值提前2.3個迴圈左右,以此類推,當然這是理論值;另外陰性對照不能有擴增(40個迴圈以後出ct值屬正常現象,也可算作沒有擴增)。
2、溶解曲線:溶解曲線是判斷擴增產物是否單一的曲線,顧名思義,其跟模板(或其濃度)沒有關係,擴增什麼基因就應該有其相對應的溶解曲線,類似於電泳。那麼你擴增幾種基因就應該有幾種對應的峰(一般sybr法的目的基因在80~90°C之間),我說的是一般情況,這個跟擴增片段長短有關係。
出現其他峰就該考慮是否為引物二聚體(一般為60~75°C之間)視引物長度而定,而基因組dna汙染的峰會在90°C以後。出現引物二聚體可能是引物設計、引物加量等原因(也有可能是從加完反應液到上機開始pcr這之間的時間過長)所致;基因組dna那麼考慮設計跨內含子引物或者實驗之前做gdna的消除工作。而陰性對照有目的峰那可能就是模板汙染,注意實驗操作等避免模板汙染。
純手打,支援下。
11樓:匿名使用者
擴增曲線要是s形的,融解曲線要單峰。滿足這些條件結果才可靠
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