1樓：匿名使用者
基因敲出質粒轉染可以構建穩定細胞株。
一種是脂質體轉染後，單轉殖篩選穩定細胞株。另外一種是應用逆轉錄病毒，慢病毒轉染，篩選穩定細胞株。
脂質體轉染：在轉染24小時後，消化細胞並計數。將細胞種到96孔板，保證每個孔2-3個細胞，這樣才能得到單轉殖。
待細胞貼壁後，加入抗生素篩選。篩選時間和濃度視細胞而定。一般g418乙個星期作用，嘌呤黴素2-3天。
脂質體法篩單轉殖時間較長，且效率低，大概只有1%.
病毒轉染：先要用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，再用病毒轉染目的細胞。包裝病毒視不同型別的病毒而定，一般要3-5天的時間。
包裝好的病毒要測滴度，根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株。
病毒轉染得到穩定細胞株的效率高，只是步驟繁瑣。
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day 5-15 轉染驗證
2樓：機器
crispr-cas9學習筆記。
cre-loxp條件性基因系統--學習筆記。
flp-frt系統--誘導性基因inducible gene editing
crispr-cas9基因敲除sgrna設計。
crispr-cas9（三）--sgrna設計好之後。
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day 1
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day 2
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day 3
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day 4
這裡我不再放詳細的實驗步驟了，因為我的實驗記錄本已經詳細的記錄了實驗步驟和條件，沒有多餘的時間再重新弄乙個，可以自行回去查詢文獻對照protocol
上次我的day 4做完之後，接著就要轉293t細胞來驗證一下質粒的效果了。簡單描述以下前期的思路（其實是我自己在回顧），先準備好需要用的東西：cas9 backbone質粒，根據基因靶點將sgrna設計好（順帶設計一下引物），將sgrna插入到cas9 backone質粒中，將質粒轉入感受態細胞擴增，提取質粒後酶切驗證。
接著就是293t細胞轉染驗證了。
使用常規的轉染試劑lipofectamine 3000或者羅氏等其他公司的轉染試劑，按照protocol嚴格操作即可。
昨天和今天都提取了基因組dna，就醬紫。
感謝師兄dz
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